Atividade antifúngica de óleos essenciais

Igara de Oliveira Lima, Rinalda de Araújo Guerra Oliveira, Edeltrudes de Oliveira Lima*, Nilma Maria Porto Farias, Evandro Leite de Souza Universidade Federal da Paraíba, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Laboratório de Micologia, 58051-970, João Pessoa, PB, Brasil.


RESUMO: A candidíase apresenta-se como uma infecção fúngica superfi cial ou profunda causada por leveduras pertencentes ao gênero Candida, sendo considerada a principal infecção micótica em ambiente nosocomial. O objetivo do presente estudo foi determinar a concentração inibitória mínima - CIM do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume, Citrus limon Risso, Eucalyptus citriodora HK, Eugenia unifl ora L., Peumus boldus Benth e de Rosmarinus offi cinialis L. sobre cepas de Candida albicans, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. stellatoidea e C. tropicalis. Os ensaios de atividade antifúngica foram realizados através da técnica de difusão em meio sólido. Os óleos essenciais de C. zeylanicum e P. boldus mostraram os mais destacáveis resultados, visto que inibiram o crescimento de 58% das cepas ensaiadas e apresentaram CIM de 4%. Unitermos: Atividade antifúngica, Óleos essenciais, Cândida, leveduras, micoses. ABSTRACT: “Antifungal activity from essential oils on Candida species” Candidiasis occurs as a superfi cial or profound fungal infection caused by yeasts belonging to the Candida genus. This infectious has been considered the main mycotic infection in the nosocomial environment. The aim of this study was to determine the minimum inhibitory concentration – MIC of Cinnamomum zeylanicum Blume, Citrus limon Risso, Eucalyptus citriodora HK, Eugenia unifl ora L., Peumus boldus Benth and Rosmarinus offi cinialis L. essential oils against Candida albicans, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. stellatoidea e C. tropicalis strains. The antifungal activity assays were carried out by solid medium diffusion technique. C. zeylanicum and P. boldus essential oils showed the most prominent results which inhibited the growth of 58% of the assayed yeasts strains and presented MIC of 4%. Keywords: Antifungal activity, essential oils, Candida, yeasts, mycoses.


INTRODUÇÃO Espécies de Candida e de Criptococcus são reconhecidas como as leveduras mais usualmente envolvidas na etiologia de infecções micóticas. A candidíase caracteriza-se como a infecção fúngica mais comum, sendo C. albicans seu agente etiológico mais freqüente. Ainda, outras espécies inseridas no gênero Candida (e.g. C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. stellatoidea, C. tropicallis) também podem estar envolvidas na etiologia da candidíase. Os quadros clínicos mais rotineiramente reportados relacionados à candidíase são a do tipo cutâneo-mucosa, sistêmica/visceral e alérgica (Lacaz et al., 1991; Anaisse, 1992; Sidrim; Moreira, 1999). Os pacientes imunocomprometidos possuem uma maior probabilidade de serem acometidos por infecções fúngicas, como os indivíduos portadores de leucemia, linfoma, diabetes mellitus e síndrome da imunodefi ciência adquirida. Os fungos são de uma forma geral, organismos do meio externo excetuando-se algumas espécies de Candida. Desta forma, os fungos que entram em contato com o ser humano e animais podem causar alguns danos, os quais podem variar de micoses superfi ciais benignas (e.g. piedra nigra) até micoses mais severas (e.g. murcomicoses) (Hazen, 1995). Uma grande quantidade de fármacos obtida através da síntese orgânica têm sido utilizada no tratamento de infecções micóticas. Os antisépticos como tintura de iodo, violeta de genciana, ácido salicílico e benzóico, derivados sulfamídicos, corantes, quinonas, antifúngicos poliênicos (e.g. nistatina, anfotericina) têm sido amplamente utilizados na terapia antimicótica (Berhan, 1957; Cury et al., 1977; Nassis et al., 1989). Ainda, faz-se uso dos chamados antifúngicos modernos, a citar os azóis (cetoconazol, econozal, sulconazol, miconazol, clotrimazol, feuconazol), alilaminas (naftina, terbinafi na), hidroxipiridona, morfolina, compostos de selenium e anfotericina B lipossômica (Recio et al., 1989; Crissey et al., 1995). Com freqüência, as infecções fúngicas são de difícil tratamento, fato intrinsecamente relacionado à aquisição por parte de seus agentes etiológicos de resistência frente à ação de antifúngicos (Araújo et al., 2004). Os óleos essenciais constituem os elementos voláteis contidos em muitos órgãos vegetais, e, estão relacionados com diversas funções necessárias à sobrevivência vegetal, exercendo papel fundamental na defesa contra microrganismos (Siqui et al., 2000). Ainda, tem sido estabelecido cientifi camente que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (Bhavanani; Ballow, 1992). Oliveira et al. (2006) verifi caram que o óleo essencial de E. citriodora apresenta sinergismo com ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina frente S. epidermidis. Com relação a S. aureus, houve diminuição da atividade inibitória de ampicilina, cloranfenicol e gentamicina. Tetraciclina, quando aplicado em combinação com o óleo essencial de E. citriodora evidenciou sinergismo nas interações com todas as bactérias testadas. E. citriodora tem se caracterizado como uma das espécies mais utilizadas no nordeste brasileiro como planta medicinal (Estanislau et al., 2001). Pessini et al. (2003) avaliaram 13 plantas usadas freqüentemente na medicina popular para o tratamento de doenças infecciosas. Entre as plantas Eugenia unifl ora inibiu o desenvolvimento de algumas cepas de bactérias e fungos. Os resultados obtidos vêm corroborar com a crença popular que utiliza essas plantas no tratamento de várias doenças infecciosas. Bara e Vanetti (1997/1998) avaliaram o potencial antibacteriano de dezesseis espécies de plantas tidas como medicinais. Os extratos hidroalcoólicos das espécies Cinnamomum zeylanicum e Rosmarinus offi cinalis estavam entre os menos ativos. Nesta perspectiva, muitos estudos têm sido realizados com ênfase na busca de novos produtos naturais ou sintéticos possuidores de atividade antimicrobiana atrelada a uma menor toxicidade ao hospedeiro (Anaisse, 1992; Edwards Jr; Filler, 1992; Graybill, 1992). O objetivo deste trabalho foi avaliar a efi cácia de óleos essenciais de plantas medicinais na inibição do crescimento de espécies de leveduras pertencentes ao gênero Candida. MATERIAL E MÉTODOS Óleos essenciais Os óleos essenciais que tiveram sua atividade antifúngica avaliada foram obtidos de seis espécies vegetais regionais de reconhecidas propriedades medicinais (Tabela 1). As referidas espécies foram identifi cadas pelo botânico Dr. José Roberto Lima, sendo catalogadas e registradas no Herbário Lauro Xavier Filho, Departamento de Sistemática e Ecologia, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, UFPB. Os óleos essenciais foram extraídos no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, UFPB através da técnica de hidrodestilação (Matos et al., 1981).


Espécies fúngicas C. albicans FCF-243, C. albicans ATCC-76615, C. guilliermondii MD-92, C. guilliermondii LM-6T, C. krusei FCF-161, C. krusei FCF-281, C. parapsilosis ME2, C. parapsilosis MD-6, C. stellatoidea LM-41V, C. stellatoidea LM46V, C. tropicalis MD-40, C. tropicalis MD-127 foram utilizadas como microrganismos testes. As cepas foram mantidas em ágar Sabouraud dextrose - ASD a uma temperatura de 4 °C, sendo utilizados para os ensaios repiques de 24 horas em ASD incubados a 35 °C. No estudo da atividade antimicrobiana utilizou-se um inóculo fúngico de aproximadamente 106 UFC/mL padronizado de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland. Ensaios de atividade antifúngica Os ensaios de avaliação da atividade antifúngica dos óleos essenciais foram realizados pelo método de difusão em meio sólido utilizando cavidades em placa (Cleeland; Squires, 1991; Hadaceck; Greger, 2000). Em placas de Petri estéreis foi adicionado 1 mL da suspensão fúngica, em seguida verteu-se 20 mL de ASD fundido e resfriado a 45-50 °C. Após solidifi cação do ágar, foram feitas cavidades com cânulas de vidro estéreis (6 mm de diâmetro) onde depositou-se 50 μL da solução ajustada na concentração desejada do óleo essencial testado. O sistema foi incubado por 24-48 a 35 °C. Após término do período de incubação, foi considerado como CIM àquela concentração do oléo essencial capaz de desenvolver um halo de inibição do crescimento fúngico maior ou igual a 10 mm de diâmetro. Paralelamente, foram realizados controle da viabilidade das cepas de leveduras ensaiadas. Ainda, realizou-se controle de sensibilidade das cepas ensaiadas frente à ação do Tween 80 e do antifúngico padrão cetoconazol (50 μg/mL), sendo ambos os ensaios realizados através da técnica de difusão em meio sólido utilizando discos de papel de fi ltro (Bauer et al., 1966). RESULTADOS E DISCUSSÃO A Tabela 2 mostra os resultados dos ensaios para a determinação da CIM dos óleos essenciais de C. zeylanicum, C. limon, E. citriodora, Eugenia unifl ora, P. boldus e R. offi cinalis. Observa-se que todos os óleos essenciais apresentaram efetividade de inibição de pelo menos uma cepa fúngica ensaiada, caracterizado pela formação de halos de inibição do crescimento microbiano com diâmetro igual ou superior a 10 mm. Entre os resultados obtidos, ressalta-se a atividade anti-Candida mostrada pelos óleos essenciais de C. zeylanicum e P. boldus, visto ambos inibirem o crescimento da maioria das cepas ensaiadas (58%). Esta destacável propriedade de inibição pode ser verifi cada quando observado os diâmetros dos halos de inibição do crescimento das leveduras (10-23 mm) frente à ação da CIM de tais óleos essenciais. A sensibilidade das cepas de leveduras frente aos óleos essenciais de C. zeylanicum e P. boldus apresentouse diferenciada, pois ocorreu o desenvolvimento de halos de inibição do crescimento com diferentes diâmetros quando da ação dos dois óleos essenciais na concentração de 4% (e.g C. albicans ATCC-76615, C. guilliermondii LM-6T). Esta diferenciada propriedade antifúngica entre estes dois óleos essenciais também pode ser verifi cada pelo fato de uma cepa mostrar-se sensível a um óleo essencial e resistente ao outro (e.g. C. krusei FCF-161, C. tropicalis MD-127). Cabe ressaltar que as cepas de C. guilliermondii MD-92 e C. stellatoidea MD-40 apresentaram comportamento de resistência aos óleos essenciais de C. zeylanicum e P. boldus. Os resultados obtidos neste estudo considerando os óleos essenciais de C. zeylanicum e P. boldus encontram-se compatíveis com os achados de outros autores (Farias; Lima, 2000; Belém, 2002; Araújo et al., 2004). Tais pesquisas encontraram que estes óleos essenciais apresentaram CIM entre 2 e 8% quando em interação com cepas de bactérias (Staphylococus, Listeria e Pseudomonas) e fungos (Candida e Malassezia). Os óleos essenciais de C. limon, E. citriodora e R. offi cinalis mostraram uma baixa efetividade antifúngica quando comparado aos resultados obtidos com os óleos essenciais de C. zeylanicum e P. boldus. O óleo essencial de E. unifl ora apresentou um baixo poder de inibição sobre as cepas de Candida, porém detectou-se atividade inibitória sobre C. krusei FCF-281. De uma forma geral, C. tropicalis mostrou-se como a espécie mais resistente à ação dos óleos essenciais testados. O óleo essencial de C. limon a 4% inibiu 05 (42%) das cepas ensaiadas, sendo desenvolvidos halos de inibição de crescimento com diâmetro igual ou próximo a 10mm. Resultados similares foram registrados por Belém (2002) em avaliação da efetividade de tal produto na inibição do crescimento de M. furfur. O óleo essencial de R. offi cinalis mostrou-se ativo somente sobre 04 cepas ensaidas, sendo observado halos de inibição com diâmetro de no máximo 12mm (C. krusei FCF-281, C. parapsilosis MD-6). Esta incipiente propriedade antileveduriforme do óleo essencial de R. offi cinalis também foi observada por Araújo (2003) sobre cepas de Candida isoladas de meio ambiente. O óleo essencial de E. citriodora a 8% mostrou-se ativo na inibição de quatro cepas ensaiadas com formação de halos de inibição com diâmetro de até 24 mm (C. guilliermondii LM-6T). Pontes (2002) observou que o óleo essencial de E. citriodra em concentração de 8% apresentou satisfatório poder antifúngico quando em interação com cepas de Trichosporon inkin. A maior ou menor atividade biológica dos óleos essenciais tem se mostrado dependente da composição de seus constituintes químicos como citral, pineno, cineol, cariofi leno, elemeno, furanodieno, imoneno, eugenol, eucaliptol, carvacrol e outros. Estes constituintes são responsáveis pelas propriedades antissépticas, antibacteiranas, antifúngicas e antiparasíticas (Craveiro et al., 1981; Souza et al., 2005). Considerando a resistência das leveduras pertencentes ao gênero Candida frente aos antifúngicos atualmente utilizados, pode-se inferir que a pesquisa de busca de novos compostos antifúngicos de origem vegetal mostra-se de relevante signifi cância. É possível observar o potencial antibiótico que os produtos vegetais possuem, e por conseqüência, a real possibilidade de aplicação destes produtos na prevenção e tratamento de doenças infecciosas de origem fúngica. Porém, é necessário citar a necessidade de realização de estudos de cunho toxicológico e clínico como suporte de segurança para o uso destes produtos como fármacos.